藏黄牛与宣汉黄牛心脏表达谱比较

0 引言

【研究意义】由于海拔升高导致分压降低，当升高的代谢需求超过氧气供应时，心血管和呼吸系统的容量受到抑制，所以缺氧是高海拔环境下的主要环境胁迫类型，会导致代谢需求与氧气对流运输之间的不平衡，最终可引起全身性低氧血症；氧气供应不足影响动物的生理生化功能，从而抑制其生长[1-2]。宣汉黄牛广泛分布于我国四川宣汉、通江等平原地区，是我国优质的地方品种，但由于长期生活在平原，对于高原环境没有良好的适应机制。藏黄牛是以产乳为主, 乳、肉、役兼用的小型地方原始品种，由于近亲繁殖，造成了其个体小、成熟晚、生产性能低等缺陷，但其能适应低氧和低温的高海拔恶劣环境。分布在高海拔的藏黄牛与平原地区的宣汉黄牛在适应低氧环境机制上形成鲜明对比，本研究拟对藏黄牛和宣汉黄牛进行转录组比较分析，探索藏黄牛低氧适应的分子机制。【前人研究进展】微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是由 18—22个核苷酸碱基组成的非编码内源性小分子 RNA，由DNA转录产生，广泛存在于动物、植物、微生物等生物体内[3]。研究显示，在缺氧条件下， miRNA可以与低氧转录因子相互作用，参与生物体内的细胞代谢、细胞增殖、细胞分化、免疫应答、细胞凋亡和癌症的发生发展等一系列生物学过程[4-10]。miRNA通过指导RNA诱导沉默复合物（RISC）对mRNA进行切割或者阻断，影响 mRNA 的表达，从而调控其蛋白表达水平[11-12]。一个miRNA可以调控多个靶基因，同时也存在多个miRNA调节同一个靶基因，研究表明，人体约1/3的基因受到miRNA的调控[13-14]。同时，低氧能调节miRNA活性并控制转录过程中关键蛋白的活性[15]。在低氧条件下，miR-143和miR-101可以直接定位在组织细胞中的酵解酶己糖激酶，从而保护细胞免受缺氧性损伤[16-17]。ZHANG等[18]发现在鱼类缺氧时，酵解酶和己糖激酶显著上调，其调节的miRNA显着下调，表明这些酶调节的miRNA在应对缺氧时有重要作用。【本研究切入点】近年来有大量关于高原动物适应低氧的相关研究，但从miRNA角度研究藏黄牛适应低氧的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究首次对藏黄牛和宣汉黄牛进行miRNA转录组比较分析，筛选低氧适应性相关miRNA及其靶信号通路，为进一步研究藏黄牛低氧适应机制提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年4月，于西藏自治区昌都市类乌齐县和成都市郫县各选取3头健康的藏黄牛和宣汉黄牛，采集心脏组织，DEPC冲洗，锡箔纸包装迅速置于液氮保存，带回青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省、教育部重点实验室进行试验。

1.2 总RNA提取

Trizol法提取总RNA，使用Nanodrop ND-1000分光光度计和Bioanalyzer 2100生物分析仪（Agilent公司，美国）对RNA浓度及RNA完整性进行鉴定。

1.3 小RNA文库构建及Solexa测序

构建6个测序文库（藏黄牛3个，宣汉黄牛3个）：从样品中提取总RNA后，琼脂糖凝胶电泳切胶选取18—30nt的片段，连接3' 端和5' 端，对已连接两端的small RNA进行反转录和PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收纯化约140 bp的条带后构建藏黄牛和宣汉黄牛各3个文库，构建好的文库使用 Agilent 2100以及qPCR进行质控，最后利用测序平台Illumina HiSeq4000进行测序。

1.4 数据处理统计

将测序得到的原始序列过滤掉低质量、有5'端和没有3'端、不含插入片段和插入片段小于18nt、含有polyA的序列，得到的有效序列进行总数、种类和长度分布统计，并做后续分析。

1.5 基因对比分析

1.5.1 比对GenBank和Rfam数据库 运用blastn软件，尽可能去除样本中的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA。

1.5.2 基因组对比 通过Bowtie 1.1.2软件确定测序得到的sRNA序列在基因组上的位置，根据外显子和内含子在基因组的位置，找出来自mRNA降解片段的sRNA，通过 RepeatMasker version 软件将sRNA与重复序列进行比对，得到repeat associate sRNA。

1.5.3 miRNA鉴定 利用Bowtie（version 1.1.2）软件与miRBase数据库中所有物种的miRNA 序列进行比对分析，鉴定出已知保守的miRNA 及其含量，利用MIREAP_v0.2 软件预测miRNA。

1.6 差异表达分析

利用edgeR 软件，使用edgeR默认参数，对已存在miRNA、已知miRNA和预测的新miRNA进行差异表达分析。差异表达miRNA的筛选标准为表达量变化2倍以上并且P<0.05。

1.7 靶基因预测及靶基因富集分析

使用RNAhybrid（v2.1.2）+svm_light（v6.01），Miranda（v3.3a），TargetScan（Version: 7.0）3种方法进行靶基因预测，然后取3种方法得到的靶基因预测结果的交集作为miRNA靶基因预测的结果。利用R语言中clusterProfilter软件包和数据库，根据靶基因注释信息进行GO富集和KEGG通路分析。

文章来源：《心脏杂志》 网址: http://www.xzzzzzs.cn/qikandaodu/2021/0415/776.html